蛋白AG融合蛋白瓊脂糖凝膠

英文名稱：Protein AG-Berpharose FF

貨號：B2834

規(guī)格：1ml

產(chǎn)品介紹

蛋白A蛋白G瓊脂糖凝膠FF是將重組蛋白A蛋白G融合蛋白鍵合在瓊脂糖凝膠微球上形成的親和分離介質(zhì)。同單獨的蛋白A或蛋白G分離介質(zhì)相比，具有更寬廣的結(jié)合范圍，同時融合后的r-PAG降低了對pH值的依賴，允許在pH5-8進(jìn)行結(jié)合。本產(chǎn)品多用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究，及抗體固定及其它相關(guān)研究。

規(guī)格

1ml（預(yù)裝柱）、5ml（預(yù)裝柱）、10ml（預(yù)裝柱）、25ml、100ml、500ml 純化流程

以免疫共沉淀（Co-IP）舉例：

結(jié)合緩沖液：20mM磷酸緩沖液、150mMNaCl、pH7.0

洗脫緩沖液：0.1M甘-氨酸，PH3.0

中和緩沖液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

（注：所用過柱液體在使用之前建議用至少小于等于0.45μm濾膜過濾）

（1）樣品預(yù)處理：細(xì)胞、植物、動物組織裂解液樣品，最終總蛋白濃度選擇在0.5-1.0ug/ul范圍內(nèi)為宜，上樣前要確保樣品溶液擁有合適的離子強度和pH值（如：可以用結(jié)合緩沖液對樣品液進(jìn)行稀釋或透析）；哺乳動物細(xì)胞內(nèi)有多種成分可以和IgG發(fā)生結(jié)合，可能會在后續(xù)免疫印跡中出現(xiàn)非特異性條帶，可通過加入Normal IgG和Protein AG-Berpharose FF的方式預(yù)處理裂解液樣品，以降低非特異性結(jié)合。

（2）抗原-抗體復(fù)合物制備：將抗體與含有目的蛋白的裂解液混合，室溫震蕩孵育30-60min（或4-8度孵育過夜），形成抗原-抗體復(fù)合物（可根據(jù)已優(yōu)化好的抗原抗體結(jié)合條件處理）。

（注意：抗體的加入量要依據(jù)填料量，抗體的加入量過多會影響到抗原-抗體混合物與填料的結(jié)合，故建議抗體加入量為填料載量的80%）

（3）填料平衡：取適量的Protein AG Berpharose FF加入到2ml離心管中，500 r離心1min，棄上清，加入0.5ml結(jié)合緩沖液，懸浮填料，500 r離心1min，棄上清，重復(fù)兩次。

（4）抗原-抗體復(fù)合物的吸附：將抗原-抗體復(fù)合物加入到平衡好的填料中，均勻，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，促使樣品和填料充分接觸并吸附，約30min后，500 r離心1min，取上清液，留樣檢測。

（5）除雜清洗：向上述離心管中加入0.5ml的結(jié)合緩沖液，懸浮填料，進(jìn)行清洗，500 r離心1min，吸棄上清，重復(fù)兩次。

（6）抗原洗脫：

①非變性洗脫法（洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析）：向離心管中加入5倍柱體積的洗脫緩沖液，用移液器吹打5次，混勻，然后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管10min后，500 r離心1min，吸取上清液，收集洗脫組分，即為目標(biāo)抗原，收集上清液至新的離心管中，并立即加入十分之一體積的中和緩沖液中和緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性，用于后期功能分析。

     ②變性洗脫法（洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測）：向離心管中加入25ul  1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均        勻，95℃加熱5min。然后進(jìn)行離心，200 r離心1min，收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行 Western分析。

蛋白AG融合蛋白瓊脂糖凝膠