3-氨基苯硼酸-瓊脂糖

1 、產(chǎn)品介紹

NuPerley Boronate填料是在新一代高剛性瓊脂糖凝膠微球骨架的表面設(shè)計(jì)特定的間隔臂后，再偶聯(lián)3-氨基苯硼酸形成的親和層析介質(zhì)。苯硼酸配基在弱堿性條件下可與1,2-順式二醇通過可逆共價(jià)鍵形成硼酸酯，可特異性結(jié)合含1,2-順式二醇結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，包括糖蛋白（包括抗體）、酶、多糖、核苷、核苷酸和兒茶酚等多類生物分子。也可通過NADP+或ATP來輔助分離純化不能直接與填料結(jié)合的目標(biāo)分子。因特異性高，且用途廣泛，使用本產(chǎn)品的純化過程可單獨(dú)歸類為硼酸親和層析（Boronate affinity chromatography，BAC）。

2 、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；b 10 cm 柱高下的測試流速。

3、硼酸親和原理

NuPerley Boronate與1,2-順式二醇結(jié)構(gòu)形成的可逆共價(jià)鍵（硼酸酯）是層析過程的主要作用力（圖 1）。pH=8.5 以上有利于填料與目標(biāo)分子以硼酸酯的形式結(jié)合，但生物分子的分離純化較少用到pH=9.0以上的條件；pH=4.0~6.0則有利于硼酸酯的解離。除了可以降低pH將目標(biāo)分子洗脫，也可以用山梨-醇、甘露-醇等含1,2-順式二醇結(jié)構(gòu)的糖 類進(jìn)行競爭洗脫。

除了可逆共價(jià)鍵，配基中存在苯環(huán)這一疏水基團(tuán)，可能與含苯環(huán)的物質(zhì)之間存在π-π相互作用，這要求上樣緩沖液的離子強(qiáng)度不能過高，通常在~50mM，以降低疏水相互作用造成的非特異性吸附。硼酸酯的四面體結(jié)構(gòu)帶負(fù)電荷，為降低離子相互作用造成的非特異性吸附，又要求結(jié)合過程有較高的離子強(qiáng)度。NuPerley Boronate 通常在50~500mM的離子強(qiáng)度下與目標(biāo)分子有較優(yōu)的特異性結(jié)合。二價(jià)陽離子可降低離子相互作用和疏水相互作用造成的非特異性吸附，例如可在上樣緩沖液中加入0~50mM的MgCl2。Mg2+也可以抑制填料與核酸等含磷酸基團(tuán)物質(zhì)的電荷互斥作用，加入Mg2+可以增強(qiáng)結(jié)合效果。

當(dāng)形成的硼酸酯以不帶電荷的平面三角形結(jié)構(gòu)存在時(shí)，硼原子存在空軌道，可作為電荷轉(zhuǎn)移相互作用的電子受體。未質(zhì)子化的氨基是良好的電子供體，當(dāng)氨基提供孤對電子給硼原子時(shí)，硼原子形成四面體型，促進(jìn)硼酸酯的形成。但需要注意的是，當(dāng)氨基附近有羥基存在時(shí)，填料與1,2-順式二醇將無法形成硼酸酯結(jié)構(gòu)。這也是為什么乙醇胺和Tris不適合作為NuPerley Boronate的上樣緩沖液。

4 、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí)，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體做脫氣處理。

（2）填料用量計(jì)算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完全讀取的穩(wěn)定體積。NuPerley Boronate的壓縮比為~1.10。為使達(dá)到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液（原包裝中填料體積分?jǐn)?shù)為67%），使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器），為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測定和評價(jià)

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價(jià)。

4.3  平衡與上樣

在上樣前，可用上樣緩沖液（平衡緩沖液）在操作流速下平衡層析柱，觀察檢測器的變化，直到電導(dǎo)、pH 等參數(shù)不變。上樣量根據(jù)樣品的性質(zhì)和層析介質(zhì)的量進(jìn)行選擇，可在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定，例如靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。一般需要將樣品用上樣緩沖液稀釋，例如1：1稀釋。

上樣緩沖液pH通常為8.5~9.0，例如將糖蛋白從非糖蛋白中分離可用HEPES緩沖液（20mM HEPES, 20mMMgCl2,pH 8.5），從脫氧核糖核苷中分離核糖核苷可用醋酸銨緩沖液（0.25 M 醋酸銨, pH 8.8）。本填料常用的上樣緩沖體系有磷酸鹽、醋酸銨、HEPES等，一般情況下應(yīng)避免使用含氨基的緩沖液，例如 Tris-HCl體系。

4.4 洗脫

用2-3個(gè)柱體積的平衡緩沖液沖洗上樣后的層析柱，觀察檢測器的變化，直到電導(dǎo)、pH等參數(shù)不變，此時(shí)未結(jié)合的組分被清洗出去。

親和層析柱的洗脫可用恒定洗脫、梯度洗脫或者階躍洗脫。洗脫過程可以將pH降低至4~6，例如0.1M 甲酸、25mM鹽酸；也可以選擇糖類進(jìn)行競爭洗脫，如10~200mM山梨-醇；也可以用0~20 mM的EDTA；Tris可作為高效洗脫劑。

4.5  再生與在位清洗（CIP）

通常可用5 C 的洗脫液將填料再生。若有失活蛋白質(zhì)或脂類物質(zhì)在再生時(shí)洗不掉可用在位清洗（CIP）除去?？刹捎靡韵逻x擇進(jìn)行在位清洗：0.5mol/LNaOH、70%乙醇、30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質(zhì)上的雜質(zhì)，反向效果更佳。

4.6 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存。也可以用0.2 M醋酸鈉、0.1M甲酸等與洗脫、再生接近的緩沖液保存，緩沖液中可添加0.02%疊氮-化鈉以防腐，在偏弱酸性的環(huán)境中填料更穩(wěn)定。保存溫度在2~8 ℃為宜，不可凍存。

3-氨基苯硼酸-瓊脂糖