重組金黃色-葡萄球菌蛋白A瓊脂糖凝膠基球FF

1 、產(chǎn)品介紹

 ProANUPharoseFF 是一款抗體親和填料，其配基 rProtein A 為重組金黃色-葡萄球菌蛋白A，基球 NUPharose 是經(jīng)典的瓊脂糖凝膠基球，FF 為 Fast Flow 的縮寫，意味該填料可在高流速下工作。重組金黃色-葡萄球菌蛋白A 配基由大腸桿菌表達，不含動物來源，保留了野生型的 5 個結(jié)合域，因而 ProANUPharose FF 的載量遠高于野生型蛋白A 填料，對人 IgG 的動 態(tài)結(jié)合載量高于 40 mg/mL 。ProANUPharoseFF 對人、小鼠、大鼠、兔、牛等等來源的 多種類型和亞型的抗體有親和作用，可從腹水、血清、細胞培養(yǎng)上清或細胞抽提物中分 離和純化多種哺乳動物不同亞型的抗體或包含抗體 Fc 片段的基因工程重組蛋白，可滿足不同規(guī)模的研究或生產(chǎn)需求。

2 、產(chǎn)品特點與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測試條件為：10%流穿，6 min 停留時間；c 推 薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下 2~6 min 停留時間的使用條件，并非只能在該流速范圍內(nèi)工作；d 10 cm 柱高下的測試流速。

3、抗體親和層析簡介——重組金黃色-葡萄球菌蛋白 A

 ProA NUPharose FF 的配基保留了野生型重組金黃色-葡萄球菌蛋白 A 的 E 、D 、A、 B 、C 五個 IgG 結(jié)合域。每個結(jié)構(gòu)域有 58 個氨基酸殘基，以反平行的三個 α 螺旋排列， 所有結(jié)構(gòu)域都能與 IgG1、IgG2 和 IgG4 的 Fc 區(qū)結(jié)合，與 IgG3 的親和力則非常弱。蛋白 A 與 IgG 之間的特異性結(jié)合源自非共價相互作用，包括在 IgG 生理條件的溶液狀態(tài)下的 疏水相互作用、極性相互作用和氫鍵。蛋白A 主要與 IgG 的 Fc 區(qū)結(jié)合，不過也有研究 證據(jù)表明 D 結(jié)合域可以與 Fab 區(qū)結(jié)合。一般需要降低 pH 將親和作用破壞后進行洗脫， 例如 pH=3 的甘-氨酸、檸檬酸鹽和乙酸鹽等。

除了金黃色-葡萄球菌蛋白 A，重組鏈球菌蛋白 G 也可以與 IgG 結(jié)合。下表為蛋

白A 和蛋白G 對不同哺乳動物不同亞型抗體的結(jié)合情況。注：-表示不結(jié)合；+表示微弱結(jié)合；++表示中等結(jié)合；+++表示很強結(jié)合。

4 、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮 比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定 體積。ProANUPharoseFF 的壓縮比為 1.15。為使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法， 也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體，并用約 3 倍 填料體積的純化水洗滌，重復(fù) 3 次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成 50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時使用裝柱器）， 為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后， 用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降 完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處； 通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過 0.3 MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定， 標(biāo)記界面穩(wěn)定時的柱高。停泵， 打開柱頭上的閥門/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱 頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流 速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測定和評價

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用 理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。柱效測定可以采用丙酮或者 NaCl 作為樣品進行，按照下表配制樣品溶液和流動相。

根據(jù) UV 或者電導(dǎo)率曲線計算理論塔板高度（HETP）、理論塔板數(shù)（N）和非對稱 因子（As），公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2

As=a/b

其中：L 為柱高；VR 為保留體積；Wh 為半高峰寬；a 為在 10%峰高處的第一個半峰寬； b 為在 10%峰高處的第二個半峰寬。

一般來說，HETP 的數(shù)值應(yīng)小于填料平均粒徑的三倍（即 HETP/D50<3 ，D50 為填 料的平均粒徑），As 應(yīng)在 0.8~1.5 之間。

4.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

PB 緩沖液（20 mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是較為常用和通用的緩沖體系。 初始的緩沖液稱為平衡緩沖液，記為緩沖液 A。

在上樣前，需用緩沖液 A 在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要 5~10 個柱體 積的緩沖液 A，以電導(dǎo)、pH 等檢測信號參數(shù)不變且與緩沖液 A 對應(yīng)為準(zhǔn)。

上樣量可按“mg  目標(biāo)蛋白/mL 填料"來設(shè)定，通常為 DBC10% 的 50~80%，例如 ProA NUPharose FF 產(chǎn)品對人 IgG 的 DBC10%為~40 mg/mL，上樣量可控制為 20~32 mg/mL 。 在條件篩選階段，也可以降低上樣品，觀察結(jié)合、特異性和洗脫情況。上樣前需要對樣 品進行離心（10000 g 以上）、過濾（0.22 或 0.45 μm）處理，以免堵塞色譜柱。

上樣后需要 3~10 個柱體積的緩沖液 A 再平衡層析柱。

4.5  在位清洗（CIP）

若發(fā)生柱壓升高，或有蛋白與填料強烈結(jié)合無法洗脫，或有沉淀、變性蛋白時，需 要對填料進行在位清洗，可采用以下方法去除雜質(zhì)，反向清洗效果更佳。

4.6  填料保存

填料的初始保存液為 20%乙醇，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在 2~8℃ 為宜，不可凍存。