產(chǎn)品名稱：小鼠孕烯醇酮（PREG）ELISA 檢測(cè)試劑盒

英文名稱：Mouse Pregnenolone ELISA KIT Instruction

規(guī)格：48T/96T

有效期：6個(gè)月

保存條件：2-8℃

用途：本試劑盒用于體外定量檢測(cè)血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中小鼠孕烯醇酮（PREG）的含量。

檢測(cè)原理 

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。 往預(yù)先包被小鼠孕烯醇酮（PREG）捕獲抗體的包被微孔中，依次 加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹-底洗滌。 用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸 的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠孕烯醇 酮（PREG）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD  值），計(jì)算樣品濃度。 

樣品收集、處理及保存方法 

以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過(guò)程中，不得使用疊 氮鈉做為防腐劑。 

1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何 細(xì)胞刺激，將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯?于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 

2. 血漿：用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集 后的 30 分鐘內(nèi)于 2-8℃ 1000×g 離心 15 分鐘，取上清即可檢 測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 

3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng) 1000×g 離心 20 分鐘， 取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反 復(fù)凍融。 

4. 組織勻漿：用預(yù)冷的 PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘 留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織 剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的 PBS（一般按 1:9 的重量體積 比，比如 1g 的組織樣品對(duì)應(yīng) 9mL 的 PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需 要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑）加 入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞， 可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于 5000 ×g 離心 5~10 分鐘，取上清檢測(cè)。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng) 檢測(cè)。 

5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍 存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分 解凍。 

自備物品 

1. 酶標(biāo)儀（450nm） 

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200- 1000uL 

3. 37℃恒溫箱 

4. 蒸餾水或去離子水 

試劑盒組成 

操作注意: 

1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須5 在使用前達(dá)到室溫 20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。所有液體組分 使用前充分搖勻。 

2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液 體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。 

3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響 OD 值。 

4. 底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。 

6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。 

7. 平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。 

8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂 白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。 

9. 不能使用過(guò)期產(chǎn)品。 

10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品 和檢測(cè)裝置。 

試劑的準(zhǔn)備 

1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。 

2. 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按 1：20 稀釋，即 1 份的 20× 洗滌緩沖液加 19 份的蒸餾水。 

洗板方法 

1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置 1min 后甩 盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板 5 次。

2. 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液 350μL，浸泡 1min，洗板 5 次。 

操作步驟 

1. 從室溫平衡 60min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用 自封袋密封放回 4℃。 2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50μ L； 

3. 待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本 50μL，空白孔不加； 

4. 除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶 （HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體 100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴 鍋或恒溫箱溫育 60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜 置 1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次（也可 用洗板機(jī)洗板）。 

6. 每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。 

7. 每孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔 的 OD 值。 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算: 

以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)， 在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到回歸方程，將樣 品的OD值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度。

試劑盒性能 

1. 檢測(cè)范圍: 6.25 ng/ml – 100 ng/ml。 

2. 靈敏度：最-低檢測(cè)濃度小于 0.1 ng/ml。 

3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。 

 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于 10% ，板間變異系數(shù)小于 15% 

其他注意事項(xiàng):

1. 最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán) 境密切相關(guān)，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。 

2. 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，不能混用其他制造 商或者不同批次的產(chǎn)品。嚴(yán)格遵守試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到的檢 測(cè)結(jié)果。 

3. 本公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù) 責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。

4. 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì) 78 的引入導(dǎo)致 ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。 

5. 若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì) 胞數(shù)量、采樣時(shí)間等，所以可能存在檢測(cè)不出的情況。 

6. 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn) 品所使用的檢測(cè)抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測(cè)出。 

操作安全須知:

1) 所有的化學(xué)試劑理應(yīng)被認(rèn)為具有潛在危害,任何的操作都必須提前做好實(shí) 驗(yàn)防護(hù)。在操作試劑盒或處理樣本的區(qū)域請(qǐng)不要飲食。 

2) 推薦只有經(jīng)過(guò)良好實(shí)驗(yàn)室培訓(xùn)的工作人員方可操作本試劑盒。操作時(shí)請(qǐng) 佩戴合適的防護(hù)設(shè)施，例如白大衣、實(shí)驗(yàn)手套、安全眼鏡等。 

3) 請(qǐng)不要讓試劑或樣本接觸皮膚、眼睛和粘膜等身體部位。如不慎接觸， 請(qǐng)立即用大量清水清洗。 4) 試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時(shí)，請(qǐng)佩戴防護(hù)服，做好 防護(hù)眼睛、手及面部等的措施。 

5)檢測(cè)必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染，所有樣品、洗 棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)定進(jìn)行處置，嚴(yán)禁隨意丟棄。 

6)試劑盒的液體組分中，含有防腐劑，可能引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)，避免吸入煙 霧或與皮膚接觸。底物液對(duì)皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙 霧。戴上防護(hù)手套，實(shí)驗(yàn)完成后徹-底洗手。 

免責(zé)聲明 

1. 試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)，否則所產(chǎn)生的 一切后果，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)，本公司概不負(fù)責(zé)。 

2. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)者違反 說(shuō)明書(shū)操作，后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。

小鼠孕烯醇酮（PREG）ELISA 檢測(cè)試劑盒