人Ⅳ型膠原(Col-IV)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書

*部分  ELISA簡介

ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。自上世紀70年代初問世 以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用 于生物學和醫(yī)學科學的許多領域。

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。

第二部分 ELISA 的樣本實驗準備

在收集樣本前都必須有一個完整的計劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當天就進行檢測的樣本，及時儲存在4℃?zhèn)溆?。對于隔天再檢測的樣本，及時分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?，有條件的，-70℃凍存?zhèn)溆?。標本應避免反復凍融?/span>

液體類標本: 包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清等。

• 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
• 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
• 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
• 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。
• 培養(yǎng)細胞：檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
• 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑，用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
• 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
• 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

第三部分 ELISA試劑盒的檢測目的和實驗原理

1.檢測目的

本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關液體樣本中Ⅳ型膠原(Col-IV)含量。

2.實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人Ⅳ型膠原(Col-IV)水平。用純化 的人Ⅳ型膠原(Col-IV)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中 依次加入Ⅳ型膠原(Col-IV)，再與 HRP 標記的Ⅳ型膠原(Col-IV)抗 體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Ⅳ型膠原(Col-IV)呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標 準曲線計算樣品中人Ⅳ型膠原(Col-IV)濃度。

第四部分  試劑盒組成

第五部分 操作步驟

• 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀 釋。

• 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl， 然后再加待測樣品 10µl（樣品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡 量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
• 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
• 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
• 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此

     重復 5 次，拍干。

• 加酶：每孔加入酶標試劑 50µl，空白孔除外。
• 溫育：操作同 3。
• 洗滌：操作同 5。
• 顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl，再加入顯色劑 B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

     15 分鐘.

• 終止：每孔加終止液 50µl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
• 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進行。
• 操作程序總結(jié)：

第六部分  計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD  值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)， 即為樣品的實際濃度。

                                         （此圖僅供參考）

第七部分  注意事項

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未 用完，板條應裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值 大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計 算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

第八部分 檢測范圍

1μg/L -48μg/L

第九部分 保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃

2．有效期：6 個月